基于光合作用的生物分子马达与光系统Ⅱ的共组装


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贾怡, 许有前, 冯熙云, 李悦, 李广乐, 李峻柏

中国科学院化学研究所, 北京 100190

通讯联系人. 李峻柏, 电话: (010)82614087;传真: (010) 82612629;电子信箱: jbli@iccas.ac.cn

基金来源：国家自然科学基金（21433010，21872151，21320102004）

摘要：近年来分子组装技术已成为化学、物理、生物和材料等交叉学科的前沿.生物分子马达是存在于几乎所有生物系统中的天然分子机器.这些生物分子机器在细胞生命活动中参与胞内运输、能量转换和肌肉收缩等一系列重要的生命过程，起着举足轻重的作用.旋转分子马达ATP合酶是目前研究最多的生物分子机器之一.开展ATP合酶的体外重组，不仅有助于理解其在生物过程中的工作机制，而且也有助于推动生物分子马达基生物传感以及合成分子机器的发展.本综述将主要介绍本课题组近期如何设计和构建基于ATP合酶的活性仿生体系的研究进展.受植物中光合磷酸化作用的启发，我们在早期的ATP合酶与层层组装的类细胞结构体共组装的基础上，将光系统Ⅱ（PSⅡ）引入组装体中，构筑了一系列具有光响应功能的ATP合成体系，成功模拟了自然界中光合作用光能与生物能的转化过程.进一步，在天然叶绿体中引入功能组分，制备了人工杂化叶绿体，显著提高了杂化体系的光磷酸化效率.这些复合组装体既成功地模拟了自然界中光合作用的化学反应过程，也为提升光能的有效利用提供了新途径.

关键词：生物分子机器 ATP合酶光系统Ⅱ 光酸分子量子点层层组装微球多层膜

Co-assembly of Molecular Motors ATP synthase and Photosystem II based Photosynthesis

JIA Yi, XU Youqian, FENG Xiyun, LI Yue, LI Guangle, LI Junbai

Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China

Corresponding author. LI Junbai, Tel: +86-10-82614087; Fax: +86-10-82612629; E-mail: jbli@iccas.ac.cn

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (21433010, 21872151, 21320102004)

Abstract: Molecular assembly is an important frontier research in chemistry, physics, biology and material. Biomolecular motors are natural molecular machines that exist in nearly all the biological systems. These biomolecular motors play crucial roles in life activities and participate in a series of important life activities such as intracellular transport, energy transfer and muscle contraction and so on. Rotating molecular motor ATP synthase is one of the most studied biomolecular machines. The recombination of ATP synthase in vitro not only helps to better understand its working mechanism in biological processes, but also promotes the development of biomolecular motor-based devices and synthetic molecular motors. In this paper, we mainly introduce our latest progress on the design and construction of ATP synthase-based biomimetic system. Inspired by photophosphorylation in plants, we fabricated a series of light-responsive ATP synthesis systems by co-assembling ATP synthase and photosystem Ⅱ (PSⅡ) within layer-by-layer assembled cell-like structures. These systems effectively simulated the transformation process from light energy to biological energy in natural photosynthesis. Besides, we also constructed artificial hybrid chloroplasts by introducing functional components into natural chloroplasts. Compared to natural chloroplasts, these hybrid chloroplasts showed remarkable improvement of photophosphorylation efficiency for ATP synthesis. These composite assemblies well simulate the chemical reaction process of photosynthesis in nature, and provide a new way for the effective utilization of light.

Key words: biomolecular machine ATP synthase photosystem Ⅱ photoacid generator quantum dot Layer-by-Layer microsphere multilayer

分子机器是指在分子尺度上具有某种加工性能的机器, 如定向运动、开关、物质传输等^{[1, 2]}.通常所说的生物分子机器主要由蛋白质等生物分子构成, 因其尺寸多为纳米级, 又称生物纳米机器.生物纳米机器具有尺寸小、多样性、自适应、准确高效和依靠化学能或热能驱动、能进行分子调剂的特点和功能.对其深入研究能促进对生命体系中生物活动分子机制的本质认识, 也能进而推动生物分子传感器以及合成分子机器的发展^[3].

分子马达是存在于生物细胞中的纳米机器, 它主要包括两类:线性分子马达(驱动蛋白、动力蛋白、肌球蛋白等)和旋转分子马达(ATP合酶和细菌鞭毛)^[4]. ATP合酶(ATP synthase)是自然界中最小的生物分子马达, 也是目前研究最多的生物分子机器^[5~7]. ATP合酶又称为H⁺-ATPase或F_OF₁-ATPase, 广泛地存在于线粒体、叶绿体和原核细胞的细胞膜中. F_OF₁-ATPase由两个独立的部分构成: F_O是嵌入膜内的疏水蛋白质, 它负责质子的迁移; 而伸出膜外的水溶性F₁部分则负责ATP的水解或合成.每个部分由多个亚基组成, 而亚基的组成和数目在不同物种间不尽相同.膜外的F₁催化复合亚单元通过一个中心柄(stalk)和一个外周柄与细胞膜内的F_O复合亚单元相连. F_OF₁-ATPase是细胞能量转换的关键酶.它可以利用跨膜电化学梯度产生的能量, 催化二磷酸腺苷(ADP)和无机磷酸盐(Pi)合成三磷酸腺苷(ATP), 也可以利用ATP的水解来跨膜泵送质子.过去的几十年里, 科学家们将ATP合酶体外重组在脂质体上做了大量的研究^[8~11]. ATP合酶在人工组装体系中的重组可以模拟细胞在体外合成“能量货币”ATP的过程.更重要的是, 它可以打破自然反应的限制, 实现输出控制.含ATP合酶的蛋白脂质体(proteoliposome)是研究其结构与功能的理想体系^[12].为了增强体系的稳定性以及能在微观尺度上对含有生物分子马达的界面进行操控, 本课题组较早地提出了将ATP合酶重组在具有类细胞结构的微胶囊表面, 通过分子组装技术构建了一系列包含生物分子马达的复合组装体^[13~15].所获得的层层组装结构不仅提高了组装体的稳定性, 也为ATP合酶提供了与天然细胞相似的生物环境, 使得ATP合酶不仅保持了高的活性, 也发挥了其特有的生物功能.在组装体上创建生物界面构建能用于驱动马达蛋白的跨膜质子梯度, 是ATP合酶重组的挑战性科学难题, 也是实现ATP能量分子体外合成的关键问题.跨膜质子梯度通常利用以下三种方式来获得: (1)酸/碱缓冲溶液置换法, 瞬间形成的跨膜质子梯度^[13]; (2)通过酶与底物反应产生质子, 如葡萄糖氧化酶氧化分解葡萄糖产生葡萄糖酸^{[14, 15]}; (3)利用光响应的质子跨膜转移反应, 如跨膜蛋白-细菌视紫红质和光敏人工卟啉天线^{[16, 17]}等方式在膜的两侧建立质子梯度差, 从而驱动ATP合酶的生物合成.

受植物体中光合磷酸化作用的启发, 本课题组通过ATP合酶与类细胞结构的微胶囊共组装, 同时在组装体中引入光系统Ⅱ(PSII), 构筑了一系列具有光响应功能的ATP合成体系.该策略成功地模拟了自然界光合作用中光能与生物能的转化过程.进一步, 在天然叶绿体中引入功能组分, 制备了人工杂化的叶绿体, 显著提高了杂化体系的光磷酸化效率.这些复合组装体, 成功地模拟了自然界中光合作用的化学反应过程, 开辟了有效地利用光能的新途径.

1 ATP合酶和光系统II共组装的人工叶绿体

发生在叶绿体中的光合磷酸化过程是理想的光驱动ATP合成的原型.其中关键的步骤是光天线蛋白光系统II(PSII)吸收光, 在自然体系中分解水, 产生质子驱动ATP合酶的转动, 推动整个植物光合磷酸化过程的进行. PSII是唯一具有分解水能力的蛋白^{[18, 19]}.它可以通过外围的天线色素分子捕捉可见和近红外波段的光, 在蛋白反应中心的锰簇Mn₄CaO₅部分驱动水分解产生质子、电子和氧气.产生的质子可以通过随后电子转移过程中耦合的电子传递链跨膜转移, 在类囊体囊腔侧累积质子, 进而形成质子梯度.跨膜质子梯度可以推动作用链上的ATP合酶旋转来催化合成ATP.受叶绿体中光合作用的启发, 我们人工提取了光合磷酸化作用链中两种关键蛋白PSII和ATP合酶, 并将二者作为组装基元重组成一种核壳结构的类叶绿体体系^[20].首先借助共沉淀和分子交联技术制备了基于PSII的类水凝胶微球, 并以此微球为核心, 在其外表面铺展含有ATP合酶的蛋白脂质体(图 1(a)和(b)).在红光照射下, 微球中的PSII能保持其活性并产生质子(图 1(c)), 进而在PSII微球的内部和外部之间产生了跨膜质子梯度.光诱导的质子梯度随后驱动ATP合酶的旋转催化合成ATP.如图 1(d)所示, ATP浓度随光照时间的增加而增加, 而在黑暗条件下几乎不变.更重要的是, ATP生成量随着光照的变化呈现“阶梯状”的曲线改变(图 1(e)), 体现出明显的“光响应”性质.也就是说, 可以通过光照开关灵活地控制ATP的合成.这个仿生组装体系以水作为推动ATP合成的质子源, 成功实现了光合磷酸化过程的简单模拟.

图 1 (a) ATP合酶在PSII微球上的组装及ATP的光响应仿生合成的原理示意图; (b) ATP蛋白脂质体在微球表面的组装, 红色荧光来自于荧光标记的磷脂Texas Red-DHPE, 绿色荧光来自于PSII蛋白自身所结合的叶绿素分子荧光以及蛋白和戊二醛反应形成的席夫碱键C=N产生的n-π*跃迁; (c, d) PSII微球在光照前(蓝线)和光照后(红线)产生的pH的变化以及ATP的产量; (e)交替光照与暗处理刺激响应过程中ATP形成产量的变化. Fig. 1. (a) Schematic illustration of co-assembly of CF_OF₁-ATPase and PSII and light-driven ATP synthesis; (b) CLSM image of PSII microspheres modified by Texas red-labeled proteoliposomes excited at 488 and 559 nm. The fluorescence signal is contributed by the chlorophylls in PSII and Texas-red labered lipid; (c) Light-induced proton gradient and (d) ATP biosynthesis and control experiments in the dark; (e) ATP synthesis through on-off cycles of light.

在自然界, 作为主要的光合器官, 植物叶片中的栅栏组织包含着整齐的柱状细胞, 垂直于叶片表皮, 这样的结构排列可以提高光吸收.受植物叶片中的栅栏组织的启发, 我们通过层层组装和溶胶凝胶技术相结合的方法, 获得了类似叶片栅栏组织的叠状多级有序结构^[21].如图 2(a)所示, 我们首先通过静电相互作用将带有相反电荷的聚电解质层层组装在多孔聚碳酸酯(PC)膜的表面以及内孔中, 制备得到了三明治形状的多层膜结构.随后, 通过溶胶-凝胶技术在温和条件下将PSII固定在硅胶基质中.含有PSII的溶胶-凝胶被注入到聚电解质修饰的聚碳酸酯膜内.选择性除去聚碳酸酯模板, 并在其表面铺展ATP合酶脂蛋白复合体, 获得了等级的光捕获结构(图 2(b)). 图 2(c)-(f)显示这种典型的基于PSII的三明治结构由两片厚约150 nm的薄层以及单分散的外径为3 μm的“电缆”形状的微管阵列组成.从该薄膜的斜视图可以看出, 含有PSII的溶胶-凝胶镶嵌在聚电解质微管中.能量色散X射线光谱(EDX)(图 2(g))中的Mn主要分布在微管内部的溶胶-凝胶区域, 证实PSII被固定在该组装体系中.在光照条件下, 固定在溶胶-凝胶内的PSII通过分解水产生氧气、电子和质子, 电子被电子受体捕获, 同时质子累积产生的质子梯度, 用于推动ATP合酶的旋转催化合成ATP分子(图 2(h)).组装的等级光捕获结构模拟了自然光合磷酸化过程, 同时也展现出更高的光合磷酸化活性.它的ATP合成速率高达13.5 μM mg_chl^-1 min^-1, 约为天然叶绿体的14倍(图 2(i)).

图 2 (a) 等级光捕获结构的组装过程示意图; (b)仿生光捕获体系的结构示意图以及相关的光合磷酸化过程; (c-f) PSII-溶胶-凝胶@聚电解质微管阵列的扫描电镜图, (c)横截面, (d)斜视图, 除去上层聚电解质膜(e)之前和(f)之后; (g)单根电缆状微管的EDX谱图, S, N, Si, Mn元素分布和叠加图; (h)组装的等级光捕获结构的光合磷酸化活性; (i)人工组装的等级光捕获结构和天然叶绿体的ATP生成速率. Fig. 2. (a) Schematic illustration of the assembly process of the hierarchical light harvesting architectures; (b) Schematic representation of the bioinspired light harvesting system and the relevant photophosphorylation process; SEM images of (c) cross section and (d) oblique view of the PSII-sol-gel@polyelectrolyte and microtube array (e) before and (f) after removing the upper polyelectrolyte film; (g) EDX mapping of individual cable-like microtubes and distributions of the elements S, N, Si, and Mn, as well as an overlapped map; (h) Photophosphorylation activity of hierarchical light-harvesting architectures; (i) Corresponding ATP production rate in chloroplast and artificial hierarchical light harvesting architectures.

受天然类囊体结构的启发, 我们进一步将PSII与ATP合酶通过层层组装的方式组装到蜂窝状醋酸纤维素基底的孔洞中, 制备了一种人造类囊体^[22].首先, 我们利用气息图案法制备了具有规则孔洞的三维立体醋酸纤维素(CA)薄膜.带正电荷的PEI与带负电荷的PSII的通过静电吸附作用层层组装到CA薄膜的孔洞内, 形成PEI/PSII多层膜.最后, 在多层膜的表面铺展ATP合酶-脂质体, 以此来模拟天然类囊体的“一层ATP合酶包裹多层PSII”的天然优势结构.当对薄膜进行红光照射时, 透明的CA与多层PSII共组装, 使光的利用率达到极限.光照下PSII分解水产生质子, 在含有ATP合酶的磷脂膜内外形成质子梯度差, 进而驱动ATP合酶催化合成ATP分子.此外溶液中大量存在的铁氰化钾模拟了天然类囊体中Cyt b₆f的功能, 将富余的电子导出, 避免了质子与电子的重新复合, 从而推动了反应的快速进行.该组装体在结构与功能两个层面上实现了对天然类囊体的模拟, 进行体外ATP的合成.

2 自然—人工杂化叶绿体

提升光合磷酸化效率, 实现高能转化, 是长期以来国际上有效利用光能竞争研究的焦点.在上述构建人工叶绿体的研究工作基础上, 我们从天然叶绿体出发, 将其与人工合成分子或者纳米粒子共组装, 构建了系列自然-人工杂化的叶绿体体系^{[23, 24]}.鉴于跨膜质子梯度是催化合成ATP的主要驱动力, 我们主要通过在细胞膜中产生过量质子的方法来增强天然叶绿体的光合磷酸化效率.

2.1 叶绿体负载光酸分子

光产酸剂是在光照条件下能够释放质子的物质^{[25, 26]}.最近, 我们将人工合成的光产酸剂与天然叶绿体进行耦合, 期望通过原位增加质子浓度以及化学驱动势来提升叶绿体的光合磷酸化效率^[23].选择的光产酸剂需要与整合的光合作用具有良好的匹配性, 生物相容性, 并且其解离后的质子要有足够长的寿命以支持后续化学反应.鉴于此, 我们首先合成了一种亚稳态长寿命的光产酸剂MEH (protonated merocyanine).这种光产酸剂在光照下能迅速产生大量的质子, 并且具有良好的可逆性.当白光照射MEH溶液时, 溶液从黄色迅速变成无色, 并且在20 s内pH由5.5降低到3.9, 表明MEH是光诱导的强酸在分子内发生光致变色反应.当光源被移除后(黑暗条件), 溶液颜色逐渐恢复, 同时, pH值缓慢增加并在10 min后回到5.2.这表明在质子解离状态下, 长寿命的MEH是稳定的, 可作为ATP合酶旋转合成ATP的质子源.通过超声辅助的方法将合成的亚稳态长寿命光产酸剂引入叶绿体的类囊体中.在光照下, 这种自然—人工杂化叶绿体表现出增强的光合磷酸化效率, 约为天然叶绿体的4倍.这种杂化体系在制备上和前面的体系相比要简单得多, 更具有实用性.

2.2 叶绿体负载光学匹配的量子点

在叶绿体中, PSII吸收的光波长仅限于可见光范围.将紫外光转化为可被PSII吸收的可见光, 是提高太阳能利用以及光合磷酸化效率的一个好方法.半导体量子点(QDs)由于其独特而优异的光学特性而倍受关注, 在太阳能电池、生物成像、疾病诊断和治疗等领域具有广阔的应用前景^{[27, 28]}.量子点具有大的斯托克斯位移、较宽的激发光谱、良好的光稳定性、高量子产率.更重要的是, 量子点的发射波长可随尺寸、形状和成分的改变, 在可见光到近红外区间内进行调谐.最近, 我们课题组合成了与叶绿体吸收光谱光学匹配的、具有大斯托克斯位移的CuInS₂/ZnS量子点, 并将量子点负载到天然叶绿体中, 构建了一种“纳米生物”杂化的叶绿体^[24].在光照射下, CuInS₂/ZnS量子点能够强烈吸收低波长的紫外光, 在680 nm附近发射红光.发射的红光可被叶绿体中PSII有效捕获, 作为附加光源加速PSII分解水的效率, 获得更高的跨膜质子梯度, 最终提高光合磷酸化效率.与天然叶绿体相比, 这种自然—人工杂化叶绿体的光合磷酸化效率提高了2.3倍.该工作合理地将自然系统与人造光捕获纳米材料相结合, 构建了更加简易, 完全有可能进行大面积加工的杂化体系, 用于提升太阳能转换效率.

3 结论与展望

以旋转生物分子马达ATP合酶和光系统Ⅱ为活性组装基元, 利用分子组装策略, 我们设计和构筑了一系列具有光响应ATP合成功能的人工叶绿体.分子组装技术不仅可以实现两种以上蛋白的共组装, 构建生物活性体系, 还可以通过改变模板和组分, 构建与天然叶绿体类似的多腔室结构, 进而有效提高光磷酸化效率.在此基础上, 通过在天然叶绿体中负载功能组分构建了人工杂化叶绿体.与天然叶绿体相比, 杂化体系显著提高了光磷酸化效率.这些分区化/再整合的重组装方法以及“纳米生物”杂化组装策略, 成功模拟了自然界光合作用中光能到生物能的转化过程, 为深入理解光合作用机制以及有效地利用光能开辟了新途径.

参考文献

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